Miguel A. Salgado Alfaro
Profesor Titular, MSc, Dr. Cs. Med.Vet
Laboratorio de Enfermedades Infecciosas, Instituto de Medicina Preventiva Veterinaria, Facultad de Ciencias Veterinarias
Universidad Austral de Chile
miguelsalgado@uach.cl
Para contextualizar el contenido del presente artículo de extensión, es preciso definir primero el concepto diagnóstico. Su origen etimológico proviene del griego diagnostikós “distintivo, que permite distinguir”, derivado de diagignóskein “distinguir, discernir” y este de gignóskein “conocer”. Las características que se le solicitan al diagnóstico es que debe ser sensible, específico, de bajo costo y rápido. Su propósito es para hacer tamizaje, confirmación, control, certificación o pre-compra. Lo anterior se debe hacer con la prueba adecuada, para el propósito adecuado, en el momento adecuado y por el precio adecuado, por lo que para cumplir con lo anterior, el diagnóstico debe tener una base robusta en la ciencia, pero su aplicación algunos la consideran un arte.
La primera aproximación a un buen diagnóstico es primero entender que las pruebas diagnósticas se categorizan en aquellas directas y otras indirectas. Las primeras tienen por objetivo la identificación directa del microrganismo patógeno y/o partes de este, ej: cultivo, PCR, tinciones. En cambio, las pruebas diagnósticas indirectas hacen evidente la respuesta inmune en contra del patógeno, ya sea por la vía humoral o celular. La problemática que se plantea al médico veterinario de terreno es que existe una gran variedad de agentes patógenos. Es esencial tener un método de diagnóstico específico y sensible para una identificación rápida y precisa de los patógenos. Existe una variedad de pruebas de laboratorio, incluyendo cultivo y pruebas moleculares. Todos los métodos tienen sus beneficios y limitaciones con respecto a sensibilidad, especificidad, valores predictivos, velocidad y costos.
El diagnóstico de referencia en enfermedades infecciosas es el cultivo, entre cuyas ventajas destaca el aislar microorganismos viables, a partir de una muestra clínica o ambiental, es fácil para cuantificar células en una muestra y posee alta sensibilidad usando el medio apropiado. Sin embargo, como desventajas están su fácil riesgo de contaminación, se necesita alto nivel de capacitación para obtener resultados óptimos, se requiere tiempo y recursos, y se basa en la caracterización fenotípica y bioquímica de los patógenos. Por lo anterior, se ha hecho necesario un sistema diagnóstico que se sobreponga a las limitaciones del cultivo, que entregue resultados en un tiempo prudente, altamente específico y con un costo apropiado.
Dentro de las técnicas diagnósticas, la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, del inglés polymerase chain reaction) es la que mayor difusión ha tenido tanto en salud humana como animal, y aparece como una respuesta efectiva y eficiente frente a estas neesidades. La PCR es un medio para amplificar selectivamente un segmento particular de ADN. Se puede considerar como una fotocopiadora molecular. Básicamente, se amplifica in vitro un fragmento de ADN específico.
Para esto se utilizan dos cebadores o partidores de oligonucleótidos. Éstos son complementarios a las hebras opuestas de un ADN de doble hebra, y se precisa de una enzima ADN polimerasa (Taq –polimerasa), que se caracteriza por ser termoresistente y ser producida por una bacteria llamada Thermophilus aquaticus.
PRINCIPIO DE LA PCR: existen tres etapas básicas las que son comunes para todo tipo de PCR: 1) denaturación térmica: los ADNs son denaturadas por temperatura cerca de 94˚C y se producen hebras simples de ADNs. 2) anillado de los cebadores : los cebadores (“primers”) son adjuntados a la hebra simple (ssDNA) por su complementariedad. 3) extensión o polimerización: que lo realiza la Taq polimerasa.
Mullis y Faloona, obtuvieron el premio Nobel en 1983, por la síntesis específica de ADN in vitro a través de una reacción en cadena catalizada por polimerasa. En la actualidad, existen diferentes variantes de la PCR; convencional, en tiempo real o cuantitativa, PCR digital, etc.
Los beneficios de la PCR son en tiempo: es un diagnóstico más rápido lo que permite desarrollar más rápidamente un plan de acción. Confirmación: con alta especificidad, confirma identidad genómica del microoganismo patógeno, en cultivo o directo desde la muestra. Detección de infección subclínica: permite identificar y eliminar aquellos animales con infecciones subclínicas persistentes, que continúan infectando a otros miembros del rebaño. Exactitud diagnóstica: los resultados de PCR son muy confiables con un resultado positivo o negativo de alta precisión con bajos niveles de resultados falsos positivos o falsos negativos.
En la actualidad, la PCR en una herramienta central en las actividades humanas, participando no sólo en el diagnóstico molecular de enfermedades, sino que ha permitido personalizar la medicina, ha sido clave en los estudios de evolución humana, es de primera necesidad en medicina forense, esencial en el desarrollo de la agrícultura y en los estudios genómicos.
En cuanto a las aplicaciones de la técnica de PCR en medicina veterinaria, especialmente en la salud de rebaños bovinos de lechería, podemos decir que la aplicación de la PCR para la identificación de patógenos primarios responsables de cuadros como paratuberculosis, leptospirosis, tuberculosis y/o coxiellosis, su aplicación ha representado un gran beneficio diagnóstico. El desafio se presenta cuando se debe hacer diagnóstico de enfermedades compuestas por múltiples agentes, en donde muchos de ellos son patógenos secundarios u oportunistas y que incluso forman parte de las comunidades microbianas de ciertos tejidos en los animales. Ejemplo de lo anterior, son el complejo respiratorias bovino (ERB), la diarrea en terneros y la mastitis bovina. La alta sensibilidad de las pruebas moleculares es tal que los resultados positivos deben ser cuidadosamente considerados con respecto a su validez. Como ejemplo de lo anterior, no siempre un resultado positivo a E. coli, Mannheimia haemolytica o Mycoplasma spp. significa necesariamente causalidad en cuadros de diarrea de terneros, neumonia y/o mastitis subclínica en bovinos y el alcance de ese resultado debe ser manejado con mucho cuidado teniendo presente lo siguiente:
«¿Tiene sentido el resultado desde el punto de vista biológico?» para la mejor decisión en base a un criterio infectológico, se debe tener presente aspectos de la biología de las infecciones, tales como historía, epidemiología, signología, ambiente y presencia de factores estresantes. Y en cuanto a la microbiología, se debe analizar más que la presencia de un microorganismo “potencialmente” patógeno, la cuantificación o estimación de la carga bacteriana en la muestra clínica obtenida del animal.
