Las técnicas para diagnósticos se han ido modernizando, por esta razón el Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de Cooprinsem, desde hace unos meses, tiene disponible para distintos análisis la técnica de PCR.
¿Que es la prueba de PCR?
Es una sigla en inglés que significa Reacción de Cadena de la Polimerasa; es una técnica de diagnóstico o investigación ampliamente utilizada en los laboratorios por ser rápida, eficiente, muy específica y muy sensible, debido a que se trabaja buscando el material genético (ADN o ARN) de los virus, bacterias, parásitos, genes anómalos, etc. Esto permite detectar ínfimas cantidades de un patógeno y poder detectar una enfermedad o infección en etapas muy tempranas.
Se basa en multiplicar millones de veces un fragmento en particular del material genético (ADN o ARN) del o los microorganismo(s) en estudio, a través de cambios bruscos de temperatura, para posteriormente el fragmento ser analizado, secuenciado, cuantificado, etc.
Las etapas de esta prueba son:
• Extracción del ADN o ARN: en esta etapa se busca eliminar contaminación y exponer el material genético de las células que se encuentran en la muestra recibida, llamada matriz; podemos tener muestras de tejido, sangre, saliva, fecas, alimento, etc. Es de suma importancia que las muestras lleguen prontamente y en optimas condiciones al laboratorio para ser procesadas.
• Amplificación o ciclo: en esta etapa se busca crear miles de copias idénticas de un fragmento de ADN del microorganismo o enfermedad buscada en particular, para esto se pone en contacto el ADN de la muestra con un una mezcla de reactivos junto a cambios bruscos de temperatura, lo que hacen posible generar millones de copias de ADN, que luego son analizados, cuantificados e identificados.
En la actualidad los pasos de la PCR están automatizados en un equipo llamado Termociclador, este realiza los cambios de temperatura de forma controlada, optimizando cada etapa.
Los termocicladores modernos permiten obtener resultados en tiempo real, es decir, miden y cuantifican de forma simultánea las copias del fragmento de ADN buscado, esto es posible porque en la medida que se van creando, las copias del fragmento emiten fluorescencia; el termociclador mide la emisión de la fluorescencia generada, la que va ir aumentando en la medida que se van generando más copias.
En la grafica se observa como en la medida que se van repitiendo los ciclos de amplificación va aumentando la emisión de fluorescencia, esto se ve de forma inmediata en la pantalla.
El PCR hoy en día es una técnica imprescindible en múltiples ámbitos como por ejemplo en investigación bioquímica, biotecnología, terapias génicas, medicina forense, estudios de paternidad, estudios genéticos y en medicina para identificar enfermedades hereditarias y patógenos.
En medicina veterinaria se utiliza para la detección directa, rápida y precisa de ADN o ARN de diversos microorganismos patógenos que afectan a nuestros animales y mascotas, por su alta sensibilidad y especificidad permite detectar enfermedades en etapas tempranas, donde la producción de anticuerpos es lenta o en muy baja cantidad, detecta microorganismos que poseen ciclos vitales variados o con estadios complicados, enfermedades secundarias que pueden dar resultados falsos negativos con otras técnicas diagnósticas, microorganismos de cultivo lento y difícil, etc.
Actualmente, en nuestro laboratorio los análisis disponibles utilizando esta técnica son los siguientes:
MUESTRA DE FECA
1. PCR de Paratuberculosis
La Paratuberculosis, también conocida como enfermedad de Johne, es causada por la bacteria Mycobacterium avium spp paratuberculosis (MAP) en rumiantes incluidos bovinos, caprinos, ovinos, ciervos y búfalos. La enfermedad de Johne, se caracteriza por ser una enfermedad crónica en rumiantes adultos y que tiene un desenlace fatal una vez que aparecen los signos clínicos. La principal característica es una diarrea profusa que no responde a tratamientos, acompañada de disminución de la producción de leche y pérdida de peso. Vacas en lactancia infectadas, pueden además presentar elevados recuentos de células somáticas, aumentos en casos clínicos de mastitis, laminitis y disminución de la fertilidad.
El PCR nos permite identificar Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP), en muestras de feca individual o pool de hasta 10 muestras. La ventaja de este análisis es que puede pesquisar la bacteria en etapas tempranas donde el animal está eliminando gran cantidad de Mycobacterium al medio ambiente y no se pueden pesquisar los anticuerpos o evidenciar la enfermedad clínica.
2. PCR para Diarreas en terneros
La Enteritis de los terneros, también conocida como diarrea, es un problema importante en las producciones lecheras y de carne porque puede tener serias implicaciones económicas. Los terneros pueden morir en casos severos, sin embargo, los terneros que sobreviven tendrán un rendimiento más bajo en comparación con los terneros sanos. Varios patógenos están asociados con la diarrea de los terneros, incluidas bacterias, virus y parásitos.
Este análisis nos permite detectar de forma simultánea bacterias, virus y parásitos patógenos vinculados a la diarrea de los terneros. A continuación se detalla los microorganismos que se pueden identificar.
MUESTRA DE LECHE
1. Otro PCR de gran importancia y utilidad hoy es para un microorganismo que es difícil de cultivar y diagnosticar, llamado Mycoplasma bovis, que es una bacteria muy contagiosa, que no posee tratamiento y que está implicada en diferentes cuadros clínicos en el ganado bovino, principalmente procesos respiratorios en terneros, mastitis en vacas, además de artritis, otitis y otras afecciones menos frecuentes como meningitis e infertilidad; por estas razones es de suma importancia tener disponible este análisis rápido, sensible y especifico en muestras de leche. Existen dos alternativas de PCR para dignosticar el Mycoplasma bovis:
PCR de Mastitis de 16 microorganismos:
Este análisis nos permite, además de detectar Mycoplasma bovis, identificar a otras bacterias de gran importancia para el control de la mastitis bovina y que son consideradas como importantes agentes etiológicos de esta enfermedad. Tal es el caso de Prototheca spp, Staphylococcus aureus, E coli y Strptococcus uberis, entre otros.
En la lista que se muestra a continuación esta el detalle con todos los microorganismos que es posibles identificar, en forma simultánea, al realizar un análisis, ya sea, a partir de una muestra de leche individual o desde un estanque predial:
Microorganismo
- Bacillus spp/Clostridium spp
- E. coli
- Enterobacterias
- Klebsiella spp.
- Lactobacillus lactis / Enterococcus spp
- Mycoplasma bovis
- Mycoplasma spp.
- Curvas de fluorescencia en termociclador en tiempo real
- Prototheca spp.
- Pseudomona spp
- SCN
- Staphylococcus aureus
- Staphylococcus betalactamasa
- Staphylococcus spp.
- Streptococcus agalactiae
- Streptococcus dysgalactiae
- Streptococcus uberis
- Streptococcus spp
2. PCR sólo para Mycoplasma bovis:
Este análisis nos permite identificar sólo Mycoplasma bovis y Mycoplasma spp a partir de muestras de estanque de leche predial o muestras de leche provenientes de uno o más cuartos de un animal en particular.
Es importante destacar además, que en la actualidad, utilizando esta técnica, es posible realizar el diagnóstico de importantes enfermedades que afectan tanto al ganado bovino, caprino y ovinos, entre otros.
De las muestras analizadas a Diciembre de este año debemos destacar:
• En 5,8 % de muestras de leche para cultivos microbiológicos que han tenido un resultado negativo, es decir, sin crecimiento bacteriano, ha sido posible identificar Mycoplasma bovis.
• En 5,8% de los estanques prediales analizados se ha diagnosticado Mycoplasma bovis.
Por los resultados descritos, la búsqueda activa de este microorganismo nos permite disminuir el impacto negativo que causa en los planteles lecheros y su control periódico permite mantener bajo control los efectos adversos que ocasiona en la sanidad mamaria.
Por todas las aplicaciones descritas y para ponerla al servicio de la Medicina Veterinaria es que el Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de Cooprinsem ha implementado la técnica de PCR; hoy con una pequeña variedad de diagnósticos pero en la medida que transcurra el tiempo y se generen las necesidades iremos ampliando el abanico de éstos y de los tipos de muestra en los que se puedan utilizar.